Imágenes dinámicas en 3D del flujo sanguíneo cerebral en ratones despiertos usando auto

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 298 (2023) Citar este artículo

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El flujo sanguíneo cerebral (FSC) se usa ampliamente para evaluar la función cerebral. Sin embargo, la mayoría de los estudios preclínicos de CBF se han realizado bajo anestesia, lo que confunde los hallazgos. Las imágenes CBF de alta resolución espaciotemporal de animales despiertos son un desafío debido a los artefactos de movimiento y el ruido de fondo, particularmente para las imágenes de flujo basadas en Doppler. Aquí, informamos sobre la tomografía Doppler de coherencia óptica (µODT) de ultra alta resolución para obtener imágenes en 3D de la dinámica de la velocidad CBF (CBFv) en ratones despiertos mediante el desarrollo de un aprendizaje profundo autosupervisado para eliminar el ruido de la imagen y eliminar los artefactos de movimiento. Comparamos el CBFv cortical en ratones despiertos versus anestesiados y sus respuestas dinámicas en redes arteriolares, venulares y capilares a la cocaína aguda (1 mg/kg, iv), una droga altamente adictiva asociada con toxicidad neurovascular. En comparación con despierto, el isoflurano (2-2,5 %) induce vasodilatación y aumenta el CBFv en 2-4 min, mientras que la dexmedetomidina (0,025 mg/kg, ip) no cambia el diámetro de los vasos ni el flujo. La cocaína aguda disminuye el CBFv en la misma medida en la dexmedetomidina y en los estados de vigilia, mientras que las disminuciones son mayores con el isoflurano, lo que sugiere que la vasodilatación inducida por el isoflurano podría haber facilitado la detección de la vasoconstricción inducida por la cocaína. Los ratones despiertos después de la cocaína crónica muestran una vasoconstricción severa, disminuciones de CBFv y adaptaciones vasculares con vasos arteriolares/venulares de buceo extendidos que priorizan el suministro de sangre a los capilares corticales más profundos. La plataforma de imágenes 3D que presentamos proporciona una poderosa herramienta para estudiar los cambios dinámicos en los diámetros y la morfología de los vasos junto con las redes CBFv en el cerebro de los animales despiertos que pueden avanzar en nuestra comprensión de los efectos de las drogas y las enfermedades (isquemia, tumores, cicatrización de heridas).

El flujo sanguíneo cerebral (FSC) es crucial para mantener el suministro de energía necesario para respaldar la actividad sináptica a través del acoplamiento neurovascular. Por lo tanto, el CBF junto con otras medidas hemodinámicas se ha utilizado para vincular las señales dependientes del nivel de oxigenación de la sangre (BOLD) de la resonancia magnética funcional (fMRI) con la actividad a nivel celular de las neuronas y los astrocitos1,2. Sin embargo, las técnicas actuales para obtener imágenes cerebrovasculares in vivo de animales de experimentación se ven obstaculizadas principalmente por el equilibrio entre la profundidad de las imágenes y la resolución espaciotemporal. Estos incluyen resonancia magnética funcional de campo alto con resolución de un solo vaso hasta arteriolas y vénulas y resolución temporal rápida para resolver cambios en el volumen sanguíneo cerebral (CBV) y BOLD provocados por la activación cerebral3, microscopía de ultrasonido basada en microburbujas para imágenes vasculares profundas transcraneales con una resolución cercana a la capilar y seguimiento rápido de la velocidad de los glóbulos rojos (vRBC)4, e imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano de longitud de onda larga (NIR-II, p. sensibilidad5,6. La microscopía fotoacústica (PAM) permite la obtención de imágenes microvasculares sin etiquetas en 3D de los lechos capilares y el mapeo de los estados de oxigenación de la hemoglobina en estos vasos en la corteza del ratón a una profundidad de hasta ~0,8 mm7. La microscopía de fluorescencia multifotónica es capaz de lograr una resolución espacial y un contraste de imagen excelentes para resolver redes capilares 3D a una profundidad de 1,6 mm en la corteza del ratón y medir vRBC contando los glóbulos rojos (flujo) teñidos con fluorescencia que fluyen a través de un capilar8,9,10. La angiografía de coherencia óptica de ultra alta resolución (µOCA) y la tomografía Doppler (µODT) tienen ventajas para la obtención de imágenes en 3D de microvasculatura y redes de velocidad CBF (CBFv) con resolución capilar, en mayor detalle (p. ej., redes de flujo arteriolar, venular y capilar), y en profundidades de 1,2 a 1,6 mm desde la superficie de la corteza del ratón11,12,13,14. µODT también ha demostrado sensibilidad y resolución para capturar la respuesta de la red CBFv microcirculatoria a una interrupción con láser de una arteriola o un capilar, y para detectar microisquemia cortical inducida por cocaína, interrupción vascular, neoangiogénesis y adaptación, todo ello habilitado tanto por su campo relativamente grande de vista y alta resolución espaciotemporal15,16,17.

El uso indebido de cocaína aumenta el riesgo de complicaciones neurológicas potencialmente mortales, como accidentes cerebrovasculares, hemorragias y ataques isquémicos transitorios. Alrededor del 25% al ​​60% de los accidentes cerebrovasculares inducidos por la cocaína se pueden atribuir al vasoespasmo cerebral y la isquemia18,19,20,21. La vasoconstricción parece jugar un papel importante entre los factores responsables de la isquemia19,22,23. De hecho, la vasoconstricción cerebral después de la provocación aguda con cocaína ha sido documentada angiográficamente en humanos22,24. Los estudios de imágenes cerebrales han documentado marcadas disminuciones en el flujo sanguíneo cerebral (CBF) y el volumen sanguíneo (CBV) en consumidores de cocaína24,25 y cerebros de animales26,27. A pesar de los avances en el conocimiento derivados de las tecnologías de imagen como PET y MRI sobre los efectos de la cocaína en la recompensa cerebral, se sabe menos sobre los efectos agudos y crónicos de la cocaína en las redes cerebrovasculares in vivo. Nuestro µODT 3D mide el efecto Doppler intrínseco de mover los glóbulos rojos para obtener imágenes de CBFv, evitando la necesidad de agentes de contraste. Esto es muy deseable para los estudios de imágenes longitudinales de las exposiciones a la cocaína. Nuestro µODT permite obtener imágenes en red 3D CBFv a través de arterias, venas y capilares28 y sus respuestas a las activaciones cerebrales en diferentes capas corticales. 3D µOCA/µODT es: (1) cuantitativo, (2) sin etiquetas, (3) de sensibilidad de alta velocidad (<20 µm/s), (4) de alta resolución espacial (<6 µm), y (5 ) capaz de cubrir un volumen cortical relativamente grande (p. ej., 3 × 2,4 × 1,5 mm3) rápidamente.

Sin embargo, la mayoría de los estudios preclínicos de la microvasculatura se han realizado bajo anestesia, lo que introduce factores de confusión de los agentes anestésicos en las actividades celulares (p. ej., neuronal, astrocítica) y la hemodinámica cerebral (p. ej., FSC, cambios en la oxigenación)29,30,31. De manera similar, la mayoría de los estudios del efecto de la cocaína sobre el flujo sanguíneo cerebral en animales de laboratorio se han realizado bajo anestesia, lo que podría afectar las respuestas fisiológicas a la cocaína30,32. Por lo tanto, los estudios de neuroimagen han comenzado a obtener imágenes de animales despiertos2,30,33,34,35, lo cual es un desafío debido a los artefactos de movimiento que pueden poner en peligro el rendimiento de la adquisición de imágenes de alta resolución, especialmente para las técnicas de imágenes de flujo basadas en Doppler como 3D µOCA /µODT36,37,38. Para abordar los desafíos, aquí optimizamos una plataforma de imágenes de flujo (p. ej., configuración µODT, jaula móvil, ventana craneal) que incorpora métodos de aprendizaje profundo autosupervisados ​​para reducir de manera efectiva los artefactos de movimiento de ratones despiertos y comparar las diferencias de 3D microvasculatura (µOCA) y redes CBFv cuantitativas (µODT) en la corteza sensoriomotora en estados despiertos frente a anestesiados (p. ej., isoflurano, dexmedetomidina, ketamina). Aplicamos estas técnicas para medir las diferencias en las respuestas cerebrovasculares a la cocaína aguda entre las condiciones de vigilia frente a las de anestesia y para evaluar los efectos de la exposición crónica a la cocaína cuando se mide en ratones despiertos.

Para las modalidades de detección de flujo basadas en Doppler, las imágenes de alta resolución de la microvasculatura cerebral y las redes CBFv son muy sensibles al ruido y los artefactos inducidos por el movimiento. A diferencia de los estudios previos de imágenes in vivo en animales anestesiados, la µOCA y la µODT en 3D de animales despiertos son muy desafiantes. Para enfrentar el desafío, implementamos una estrategia que combina la optimización de la plataforma OCT y el aprendizaje autosupervisado para eliminar el ruido y los artefactos de movimiento de manera efectiva. La optimización de la plataforma OCT incluye (1) la optimización de la tasa de escaneo A y los puntos para priorizar la tasa de imágenes rápidas mientras se mantiene la sensibilidad suficiente para la detección del flujo capilar, (2) la miniaturización de la sonda para minimizar el ruido de vibración y (3) la reducción del movimiento de los animales usando soportes (p. ej., placa de cabeza de Ti, jaula de carbono flotante en el aire, preentrenamiento en cinta rodante para animales). La Figura 1 compara dos grupos de imágenes µOCA/µODT representativas en la corteza sensoriomotora de ratones despiertos antes y después del rediseño del cabezal de exploración OCT y el entrenamiento de los animales. Los paneles de la izquierda, adquiridos con nuestro escáner OCT para estudios de animales anestesiados13, muestran rayas severas inducidas por el movimiento resaltadas por flechas amarillas y un alto nivel de ruido general y borrosidad de la microvasculatura en la imagen µOCA (a), y artefactos de movimiento (flechas azul claro) y excesiva ruido de fondo en la imagen µODT (c); mientras que después del rediseño del cabezal de exploración OCT y el entrenamiento en cinta rodante de animales, los paneles de la derecha muestran artefactos de movimiento similares a rayas, borrosidad y ruido de fondo drásticamente reducidos en la imagen µOCA (b) y la imagen µODT de alta fidelidad (d) comparable a la de los animales anestesiados17. Los videos complementarios SV1 y SV2 muestran la diferencia en los movimientos antes y después del entrenamiento en cinta rodante en un ratón con la cabeza restringida. El ratón no entrenado estaba muy activo con movimientos frecuentes durante la sesión, mientras que después del entrenamiento se volvió más tranquilo y tenía muchos menos movimientos que antes del entrenamiento. Curiosamente, aunque las imágenes de µODT de redes capilares CBFv son generalmente más propensas al ruido de fase inducido por movimiento, la figura 1 muestra que los efectos de movimiento (p. ej., ruido y artefactos similares a rayas) fueron más profundos en µOCA que en µODT en animales despiertos. Esto probablemente se deba a la duración más corta entre 2 escaneos A adyacentes para reconstruir µODT (por ejemplo, ΔtµODT ≈ 2,3 ms) que entre dos escaneos B adyacentes para reconstruir µOCA (por ejemplo, ΔtµOCA ≈ 0,21 s). La mayor duración de la adquisición de µOCA (ΔtµOCA ≈ 100ΔtµODT) resultó en una degradación de imagen inducida por movimiento más severa. Además, dado que las imágenes de µODT no tienen corrección de ángulo (es decir, el ángulo del coseno entre la incidencia de la luz y la dirección del flujo) como las Fig. 1c, d, algunos flujos de ramas pueden parecer no homogéneos a lo largo de la vasculatura28. Se proporcionan análisis más detallados en la Nota complementaria S1.

Paneles izquierdos: imágenes μOCA (a) y μODT (c) adquiridas con un escáner OCT informado anteriormente; paneles derechos: contrapartes adquiridas con un escáner OCT rediseñado después del entrenamiento de animales (b, d). Las flechas amarillas y azul claro apuntan a artefactos de movimiento en imágenes μOCA y μODT, respectivamente. Tamaño de la imagen: 2,3 × 1,2 × 2 mm3.

Como se muestra en la Fig. 1, el ruido de fase inducido por el movimiento y los artefactos plantean un desafío importante para la obtención de imágenes neurovasculares de animales despiertos, especialmente para µOCA. Además de la optimización del cabezal de escaneo OCT y el entrenamiento de animales despiertos, implementamos varios métodos de procesamiento de imágenes, incluido el modelado de aprendizaje profundo39,40,41, y desarrollamos un modelo de aprendizaje autosupervisado para minimizar los artefactos de movimiento y eliminar el ruido de las imágenes µOCA y µOCA (consulte Métodos para marcos detallados). La Figura 2 ejemplifica los resultados del procesamiento de imágenes basado en el aprendizaje profundo para reducir los artefactos inducidos por el movimiento (p. ej., rayas y la borrosidad asociada de microvasos), en la que la Figura 2a es la imagen MIP proyectada desde el conjunto de datos µOCA sin procesar y la Figura 2b es la máscara de vasija binarizada derivada de la Fig. 2a mediante segmentación de aprendizaje profundo. La figura 2c es la imagen µOCA mejorada al enmascarar la figura 2a con la figura 2b, que muestra un ruido de fondo drásticamente reducido y una clara restauración de las redes microvasculares. La efectividad de nuestro marco de aprendizaje profundo es evidente por la eliminación de todos los artefactos similares a rayas (resaltados con flechas amarillas). Los paneles inferiores (Fig. 2d, e) comparan las imágenes μODT antes y después de eliminar el ruido de fondo de fase inducido por el movimiento. Los resultados en la Fig. 2 indican que el procesamiento de imágenes basado en el aprendizaje profundo minimiza el ruido inducido por el movimiento y los artefactos de los animales despiertos, lo que permite una caracterización cuantitativa más precisa de las redes microvasculares y los cambios de CBFv.

Las flechas amarillas (a) apuntan a artefactos de movimiento en μOCA que se eliminaron mediante el procesamiento de imágenes basado en aprendizaje profundo (c), donde la máscara de vasija (b) se derivó del aprendizaje autosupervisado para la eliminación de artefactos de movimiento. Los paneles inferiores muestran que la imagen μODT sin procesar (d) se eliminó de manera efectiva (e) mediante el aprendizaje autosupervisado. Tamaño de imagen 2,3 × 1,2 × 2 mm3.

Debido a los desafíos técnicos (p. ej., artefactos de movimiento), la mayoría de los estudios de imágenes cerebrales in vivo se han realizado en animales anestesiados. Sin embargo, los efectos anestésicos confunden las respuestas funcionales del cerebro a los estímulos eléctricos o farmacológicos y los cambios vasculares cerebrales asociados. De hecho, una comparación visual de las ramas correspondientes de los vasos (barras rojas/azules: vasos arteriolares/venulares) en la Fig. 3 muestra la vasodilatación inducida por isoflurano (Iso). Los análisis estadísticos en la Fig. 3e indican que los diámetros de los vasos aumentaron un 44,6 % ± 4,2 % (p* < 0,001, m = 8 vasos) en las arteriolas y un 28,2 % ± 5,0 % (p* < 0,001, m = 8) en las vénulas a través de la densidad capilar permaneció sin cambios (−0,5% ± 0,4%, p = 0,3, m = 8). Además de la vasodilatación, la Fig. 4 muestra μODT 3D de redes CBFv en estado despierto (a) frente a Iso (b) y su relación imagen (c) ΔμODT = [μODT(b)-μODT(a)]/μODT(a) para ilustrar los aumentos de CBFv inducidos por isoflurano, en los que los colores rojo y azul se refieren a aumentos y disminuciones de CBFv, respectivamente. Para rastrear la dinámica del flujo en la transición de los estados despierto a Iso-anestesiado, se seleccionó un panel más pequeño de 2.3 × 0.3 × 1.2 mm3 resaltado por un cuadro azul discontinuo en la Fig. 4a para adquirir pilas de μODT 3D de lapso de tiempo (~ 2 min / cubo) como se muestra en la Fig. 4d y las imágenes de relación en la Fig. 4e mostraron aumentos generales de CBFv excepto en dos arcadas arteriales, es decir, 2 flechas amarillas en la Fig. 4a. En función de los 16 vasos seleccionados, la Fig. 4f traza los cambios de flujo ΔCBFv(t) en vasos individuales (trazos discontinuos) y sus cambios promedio, por ejemplo, trazos rojos, azules y verdes sólidos para flujos arteriolares, venulares y capilares. El trazo negro en negrita representa los cambios de flujo generales que aumentaron después de la inhalación de isoflurano en t = 0 min y se estabilizaron en t ≈ 4 min (p. ej., 50 % ± 12,9 % de aumento; p = 0,0003, m = 16). Tanto el flujo arteriolar (FA) como el flujo venular (FV) aumentaron más del 70 % (FA: 70,9 % ± 23,1 %, p = 0,02; FV: 72,0 % ± 20,9 %, p = 0,01); luego, la FA se mantuvo relativamente estable (p. ej., 57,8 % ± 24,6 %, p = 0,05, m = 6), pero la FV disminuyó gradualmente hasta el 22,6 % ± 10,56 % (p = 0,03, m = 4). Los cambios en el flujo capilar (FC) fueron más diversos, con aumentos superiores al 150 % y descensos superiores al −82 %, lo que arrojó un aumento total del 29,5 % ± 22,8 % (p = 0,004, m = 6). La cuantificación entre animales se incluye en la Fig. 4g, lo que indica que el ΔCBF medio aumentó un 32,75 % ± 5,65 % después de la inducción con isoflurano (t = 20-30 min, ROI = 8/animal, n = 7 ratones), que es más alto que el valor inicial normalizado (0,01 % ± 6,35 %, t = −6–0 min; p* = 0,02) en estado de vigilia.

a, b Imágenes crudas de μOCA de estados despiertos frente a Iso; c, d sus correspondientes imágenes μOCA mejoradas mediante procesamiento de aprendizaje profundo; e análisis estadísticos de vasodilatación inducida por isoflurano en vasos arteriolares (AV), vasos venulares (VV) y densidad capilar (CD). Tamaño de la imagen: 2,3 × 1,2 × 2,5 mm3. Las barras rojas y azules representan cambios en el tamaño de los vasos arteriolares y venulares (Δ\({{{{\rm{\phi }}}}}}\)), la barra verde representa el cambio de densidad capilar (ΔD) debido a Iso.

a, b Imágenes μODT sin procesar de estados despiertos frente a Iso y su imagen de relación. c Tamaño de imagen: 2,3 × 2,5 × 1,2 mm3); d, e imágenes de lapso de tiempo μODT (t) y cambios de relación ΔμODT de despierto a anestesia Iso (tamaño de imagen: 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3); f Aumentos de CBFv inducidos por iso; ga comparación de ΔCBFv medio entre el estado de vigilia (t: −8–0 min) y la anestesia Iso (t: 20–30 min) entre animales (p* = 0,02, m = 8 RoI/animal, n = 7 ratones).

De manera similar, comparamos los estados anestesiados con dexmedetomidina (Dex) y despiertos. Dex es cada vez más favorecido para los estudios funcionales del cerebro animal debido a su baja interferencia neurofisiológica reportada42,43. A diferencia de la vasodilatación observada con Iso (Fig. 3), las imágenes 3D μOCA en la Fig. 5 no revelaron vasodilatación o vasoconstricción después de la inducción de Dex (0,025 mg/kg, ip). Los análisis cuantitativos en la Fig. 5c indican que no hubo cambios significativos en el tamaño de los vasos, por ejemplo, vasos arteriolares (AV): -0,3 % ± 0,7 % (p = 0,67, m = 10), vasos venulares (VV): -0,1 % ± 0,6% (p = 0,71, m = 16), y densidad capilar (CD): −0,41% ± 0,3% (p = 0,29, m = 5). La Figura 6 muestra 3D μODT de redes CBFv en estado despierto (a) frente a Dex (b) y sus imágenes de relación (c), que revelaron cambios de flujo dispersos menores, incluidos aumentos y disminuciones en arteriolas y vénulas bajo anestesia Dex. Time-lapse 3D μODT y sus imágenes de proporción en la Fig. 6d, e muestran los cambios de flujo en la transición de estados despiertos a estados anestesiados con Dex en el ROI seleccionado (cuadro discontinuo) en la Fig. 6a. La figura 6f representa los cambios de flujo relativos en vasos individuales (trazas discontinuas, n = 20) y los cambios promedio de CBFv para los compartimentos arteriolar, venular y capilar. Un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) que comparó el cambio de flujo general inducido por Dex (trazo negro en negrita) no reveló diferencias significativas durante el tiempo t = 0 min a 36 min (F(15, 288) = [1.26], p = 0,23, n = 6 animales). Los análisis separados por tipo de vaso mostraron que el flujo arterial disminuyó gradualmente a −10,5 % ± 2,61 % (p = 0,01, n = 6) en t ≥ 9 min; el flujo venular disminuyó a −14,8 ± 3,76 % (p = 0,03, n = 5) en t ≥ 16 min mientras que los cambios en el flujo capilar fueron diversos, con aumentos superiores al 62 % y disminuciones superiores al −16 %, lo que da un aumento total del 6,3 % ± 10,1% (p = 0,6, n = 8). La cuantificación entre animales en la Fig. 6g no reveló cambios significativos de ΔCBF entre el estado de vigilia o la línea de base (0,01 % ± 6,21 %, t = −8–0 min) y después de la anestesia Dex (−10,28 % ± 4,98 %, t = 20–30 min, ROI = 8/animal, n = 3 animales, p = 0,24).

a, b Imágenes crudas de μOCA de estados despiertos frente a Dex; c, d Sus correspondientes imágenes μOCA mejoradas mediante procesamiento de aprendizaje profundo; e análisis estadísticos de los cambios de tamaño inducidos por Dex en los vasos arteriolares (AV), vasos venulares (VV) y densidad capilar (CD). Tamaño de la imagen: 2,3 × 1,2 × 2 mm3. Las barras rojas y azules representan los cambios de tamaño de los vasos arteriolares y venulares (Δϕ) respectivamente; la barra verde representa el cambio de densidad capilar (ΔD) con Dex.

a, b Imágenes μODT sin procesar de estados despiertos frente a Dex y su imagen de proporción (c, tamaño de imagen: 2,3 × 2 × 1,2 mm3); d, e imágenes de lapso de tiempo μODT (t) y cambios de relación ΔμODT de despierto a anestesia Dex (tamaño de imagen: 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3); f Cambios de CBFv inducidos por Dex. AF: flujo arterial, VF: flujo venular, CF: flujo capilar; g comparación del ΔCBFv medio entre el estado de vigilia (t: −8–0 min) y la anestesia Dex (t: 20–30 min) entre animales (p = 0,24, m = 8RoIs/animal, n = 3).

Además, tomamos imágenes de la transición de estados despiertos a estados anestesiados con ketamina. Los resultados mostraron que la anestesia con ketamina en general provocó disminuciones en el CBFv regional. Sin embargo, su breve tiempo medio requirió múltiples inyecciones que llevaron a cambios CBFv inestables y heterogéneos (S3 suplementario Fig. s1).

Para explorar los posibles factores de confusión de la interacción de diferentes agentes anestésicos sobre los efectos de la cocaína en las redes cerebrovasculares, comparamos los efectos de la cocaína (1 mg/kg, iv) en la respuesta CBFv en la corteza somatosensorial entre los estados anestésicos despierto vs Dex o Iso (Fig. 7).

Cambios de CBFv inducidos por cocaína en la corteza sensoriomotora de ratones anestesiados despiertos (a-c) frente a Dex (d-f) o Iso (g-i). Paneles superiores: imágenes 3D μODT de lapso de tiempo de cambios en el CBFv inducidos por la cocaína, μODT(t), los números codificados por colores muestran las ubicaciones seleccionadas para rastrear los cambios de flujo en los paneles inferiores correspondientes; Paneles intermedios: imágenes de relación de ΔμODT(t), tamaño de imagen: 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3/panel; Paneles inferiores: cambios de CBFv inducidos por la cocaína en las redes de flujo arteriolar (AF: rojo), venular (VF: azul) y capilar (CF: verde). Los trazos de color discontinuos son cambios de flujo arteriolar (rojo), venular (azul) y capilar (verde) individuales con la cocaína.

Para cada grupo, se adquirió una imagen μODT 3D de tamaño completo (2,3 × 2 × 1,2 mm3), de la cual se seleccionó un panel más estrecho (2,3 × 0,3 × 1,2 mm3) (Suplementario S4 Fig. S3) para adquirir la dinámica de lapso de tiempo cambios en la red de flujo (~1,2 min/volumen) antes y después de la cocaína. Una comparación de los cambios de CBFv inducidos por la cocaína entre los estados de vigilia (panel izquierdo) y Dex (panel central) muestra un patrón similar de disminución del flujo general bajo anestesia de Dex de -18,5 % ± 4,17 % y en estado de vigilia de -24,3 % ± 4,76 % (p = 1, n = 5 animales). Además, las imágenes de proporción (b) mostraron que probablemente debido a una mayor actividad motora en la corteza sensoriomotora en estado de vigilia que en los estados anestesiados, los cambios de CBFv fueron más diversos, por ejemplo, mostrando episodios de rebotes de flujo corto después de la cocaína (t = 0 min) , especialmente en los flujos venosos. El aprendizaje autosupervisado para el seguimiento de artefactos de movimiento en S6 complementario La figura S5 muestra una correlación temporal entre estos episodios transitorios de CBFv y los movimientos del animal. Curiosamente, según las curvas de ΔCBFv(t) (c), las amplitudes de rebote venoso cuantificadas en estado de vigilia (12,01 % ± 0,75 %, en t = 2, 8, 20 min) fueron significativamente mayores que en estado Dex (4,85 % ± 1,64 %, en t = 9, 18, 23, 27 min, p = 0,01). Por el contrario, las disminuciones de CBFv inducidas por cocaína con Iso (panel derecho) fueron uniformes en varios compartimentos de vasos (AF, VF y CF) y mayores, es decir, −33,7 % ± 2,78 % que en el estado de vigilia (−24,3 % ± 4,76 %; p = 0,04, n = 5) o con Dex (−18,5 % ± 4,17 %; p = 0,01, n = 5 animales). Es digno de mención a partir de sus imágenes basales de campo completo (Suplementario S4 Fig. s3) y la Fig. 4 que el isoflurano dilató los vasos, lo que resultó en un aumento de ~ 46% en el CBFv inicial y facilitó la detección de la vasoconstricción provocada por la cocaína.

Las respuestas de la red CBFv a la cocaína en los animales anestesiados con ketamina mostraron cambios heterogéneos pero no significativos (p = 0.57, m = 14–16, n = 3 animales) (Suplementario S3 Fig. s2).

Además, tomamos imágenes de los efectos de la cocaína crónica en las redes cerebrovasculares de animales despiertos (n = 2). Se administró cocaína (2 × 1 mg/kg/diariamente, con 2 a 2,5 h de diferencia, iv) aproximadamente cada 3,5 días, es decir, con una dosis total fija acumulada de 13 mg/kg de cocaína durante 25 a 28 días. La Figura 8 muestra redes CBFv 3D en la corteza sensoriomotora entre el inicio (a: día 0) y después de la cocaína crónica (b: día 24). La vasoconstricción crónica inducida por cocaína mostró una reducción general en CBFv. La cuantificación mostró vasoconstricción global Δϕ (c) de −22,3 % ± 3,1 % (p < 0,001, n = 5) y −25 % ± 13,8 % para FA (p < 0,001, n = 5) y −19,8 % ± 4,3 % para FV (p = 0,01, n = 5 animales); la densidad de flujo capilar detectable ΔD se redujo en −51,7 % ± 10 % (p < 0,001, n = 5) según el análisis del mapa del esqueleto de flujo17,44 (Suplementario S5 Fig. s4). La disminución general de CBFv (d) fue −37,4 % ± −4,7 % (p = 0,001, n = 5) entre las cuales las disminuciones de flujo fueron −25,6 % ± 9,3 % (p < 0,002, n = 5), −49,1 % ± 27,3 % (p < 0,04, n = 5) y −37,6 % ± 5,5 % (p < 0,001, n = 5) para los compartimentos arteriolar, venular y capilar, respectivamente. Los análisis detallados de imágenes en 3D en la Fig. 9 indicaron que los flujos capilares disminuidos después de la cocaína crónica ocurrieron en las capas corticales superiores (0–300 µm) mientras que las capas corticales más profundas (300–1000 µm) mostraron aumentos de flujo. Curiosamente, a diferencia de las disminuciones de CBFv en conjunto en FA, VF y CF después de la cocaína aguda como se muestra en la Fig. 9b, e, h, se observaron adaptaciones vasculares, por ejemplo, redistribución vascular con árboles arteriolares y venulares extendidos en la Fig. 9c, f, i que parecía priorizar el suministro de sangre en las redes capilares más profundas después de la cocaína crónica, como lo ilustran los 6 flujos de buceo seleccionados. Los resultados adicionales se muestran en el suplemento S8 Fig. s7.

a, b Imágenes 3D μODT (2,3 × 1,2 × 2 mm3) el día 0 (control) y el día 24 (cocaína crónica). Los puntos azules sólidos y los círculos azules discontinuos muestran las ROI para el flujo de FA o VF y las cuantificaciones del flujo capilar. c, d Vasoconstricción significativa y disminución del CBFv como resultado de la exposición crónica a la cocaína en las redes de flujo arterial (AF: rojo), flujo venular (VF: azul) y flujo capilar (CF: verde).

a–c Imágenes 3D μODT (2,3 × 2 × 0,3 mm3) en la corteza superior (p. ej., L1-L3) el día 0 (control), el día 4 (cocaína aguda) y el día 24 (cocaína crónica), que muestran un CBFv capilar reducido lechos y ramas extendidas de FA y VF en caso crónico (c); d–f las imágenes 3D μODT correspondientes (2,3 × 2 × 0,7 mm3) en la corteza más profunda (p. ej., L3-L6 y por debajo), que muestran un aumento del CBFv en las ramas de FA y VF y los lechos capilares en el caso crónico (f); Vista lateral g-i de imágenes μODT para ilustrar los flujos arteriolares de inmersión y los flujos venulares ascendentes que se extienden más profundamente en las capas corticales inferiores debido a la redistribución del flujo capilar como resultado de la exposición crónica a la cocaína. Las flechas de color azul claro resaltan las profundidades extendidas de los seis flujos venulares ascendentes y arteriolares de inmersión seleccionados (i = 1, …, 6). Dosis acumuladas totales de cocaína: 3 mg/kg para casos agudos y dosis acumuladas de 13 mg/kg para casos crónicos.

La detección de fase basada en Doppler es propensa al ruido de movimiento; por lo tanto, la obtención de imágenes CBF de alta resolución en 3D de animales despiertos sigue siendo un desafío técnico. En este estudio, desarrollamos marcos de aprendizaje profundo para reducir eficazmente los artefactos de movimiento y los ruidos de fase en imágenes 3D µOCA y µODT y demostramos la eficacia de este método para obtener imágenes de alta resolución de la microvasculatura cerebral y las redes CBFv en la corteza somatosensorial de personas que se comportan despiertos. ratones. La innovación de este estudio incluye: (1) un método de aprendizaje profundo autosupervisado desarrollado e implementado (ver Métodos), que ofrece importantes ventajas sobre los métodos supervisados ​​anteriores y es adecuado para la adaptabilidad a los sistemas ODT/OCA genéricos y diferentes condiciones fisiológicas, incluida la vigilia. formación de imágenes; (2) informe sobre redes CBFv 3D de alta fidelidad (con µODT) y sus cambios dinámicos en animales despiertos; (3) comparaciones del seguimiento cuantitativo en 3D de la dinámica detallada de la red microvascular en los flujos arterial, venular y capilar en animales despiertos frente a animales anestesiados y en respuesta a la cocaína aguda; (4) documentación de adaptaciones vasculares después de la cocaína crónica (p. ej., flujo general reducido en la corteza con aumentos de flujo capilar priorizados en la corteza profunda) en ratones despiertos.

Dado que el aprendizaje autosupervisado evita la necesidad de grandes conjuntos de datos como "verdades básicas" para el entrenamiento, es especialmente adecuado para la eliminación de ruido y artefactos de movimiento en imágenes µOCA/µODT que generalmente no son prácticas de adquirir y están sujetas a cambios y variabilidades del sistema en la fisiología animal. , especialmente para estudios en animales despiertos. Por ejemplo, los resultados muestran que aunque nuestro aprendizaje supervisado anterior funcionó bien para nuestra antigua plataforma OCT en animales anestesiados39, no pudo restaurar las redes de capilares corticales en el animal despierto, mientras que el nuevo aprendizaje autosupervisado tuvo éxito (Suplementario S7 Fig. s6) . Permite imágenes µODT de alta fidelidad de la red 3D CBFv y sus cambios dinámicos en la corteza de un animal despierto. Esto proporciona una nueva herramienta para estudiar la función cerebral basada en los cambios de la red CBFv en animales despiertos, evitando los factores de confusión y las complicaciones de la anestesia. Aunque se han informado otros estudios similares de imágenes vasculares en animales despiertos45,46,47,48, se aplicaron para mejorar la OCA (angiografía por OCT). Nuestro enfoque de aprendizaje profundo es autosupervisado no solo para eliminar los artefactos de movimiento masivo en las imágenes μOCA, sino también para eliminar el ruido de las imágenes μODT en 3D en animales despiertos. En combinación con la optimización de la sonda OCT y el entrenamiento en cinta rodante de animales, mejoró drásticamente la fidelidad de la imagen, como se ilustra en las Figs. 1 y 2. Es interesante notar que µOCA fue más susceptible a los artefactos de movimiento que µODT debido a su mayor tiempo de adquisición utilizado para la reconstrucción de imágenes (Nota complementaria S1). También se debe tener en cuenta que la detectabilidad de μODT, especialmente para flujos capilares diminutos, es extremadamente sensible al ruido de fondo del micromovimiento de animales despiertos. Por lo tanto, la eliminación de ruido supervisada es necesaria para mejorar los flujos capilares (Figs. 2 y 4). Grandes artefactos de movimiento a granel también pueden ocurrir durante la obtención de imágenes de μODT de animales despiertos y pueden minimizarse mediante nuestro algoritmo de eliminación de ruido basado en el aprendizaje autosupervisado (p. ej., Fig. 7a). Debido a los artefactos de movimiento y al ruido de fase Doppler (lavado), independientemente del uso de reposacabezas (p. ej., Fig. 1), es técnicamente muy difícil lograr imágenes de flujo de animales despiertos para una modalidad basada en Doppler. De hecho, nuestros resultados demuestran imágenes de CBFv 3D de alta fidelidad (no imágenes de angiografía o vasculatura) de animales despiertos usando µODT.

Las imágenes de μODT comúnmente exhibieron múltiples puntos brillantes (flujo alto) y oscuros (flujo bajo) incluso a lo largo de los mismos vasos. Estos puntos brillantes y oscuros eran en gran medida repetibles, como los de la Fig. 9a, b adquiridos en diferentes momentos, lo que sugiere que es poco probable que se deba a que los glóbulos rojos aleatorios pasan a través de las secciones transversales de los vasos dentro de las exploraciones B de μODT. En cambio, como las imágenes μODT presentadas no se corrigieron con el ángulo Doppler θz (nota complementaria S1 para obtener más detalles), es probable que sea la causa de artefactos como puntos brillantes y oscuros a lo largo de los flujos. Presentamos una matriz hessiana 3D para rastrear el ángulo θz de los vasos, lo que permite una corrección precisa del ángulo para la cuantificación absoluta de CBFv excepto para flujos casi horizontales (p. ej., 1/cos(θz)→∞, cuando θz→900)28.

Los efectos de los anestésicos de uso común (p. ej., Iso, Dex) sobre la vasculatura cerebral y la hemodinámica en la corteza del ratón se midieron en la transición de los estados despierto a anestesiado. Aunque los efectos de los agentes anestésicos como Iso y Dex sobre la vasculatura cerebral son generalmente conocidos; mostramos aquí que los nuevos avances en µOCA/µODT nos permitieron proporcionar una caracterización más detallada, incluida la forma en que los componentes arteriales, venulares y capilares se vieron afectados por Iso y Dex, qué tan rápido reaccionaron, qué tan estables/inestables se volvieron y qué tan influyeron en las respuestas vasculares y hemodinámicas a la cocaína aguda. El nuevo avance también nos permitió evaluar los cambios en la red de flujo en las capas corticales superficiales y profundas con cocaína crónica. Estos resultados son relevantes porque muchos estudios funcionales cerebrales preclínicos se realizaron y aún se pueden realizar bajo anestesia. En este sentido, nuestros hallazgos respaldan el uso de Dex como anestésico para estudiar los efectos cerebrovasculares de la cocaína que imitan mejor el estado de vigilia.

Cabe destacar que la µODT 3D puede cerrar la brecha entre TPM (resolución espacial superior, medición precisa del flujo, pero limitada a un solo vaso o a muy pocos vasos a la vez) y otras modalidades mesoscópicas, como la obtención de imágenes de moteado láser, que es rápida pero carece de resolución capilar. e información de profundidad. Nuestros estudios muestran el valor único de µODT para estudiar las interacciones neurovasculares con alta resolución espaciotemporal y sensibilidad y en diferentes capas corticales que evitan la cuantificación sesgada de las respuestas del flujo capilar porque los flujos capilares individuales son muy diversos; por lo tanto, la capacidad de rastrear abundantes cambios de flujo capilar local es crucial. Por ejemplo, estudios previos nuestros y de otros han demostrado que la anestesia Iso deprimía las actividades neuronales y dilataba los vasos cerebrales, lo que resultaba en aumentos del CBFv19,38,39,40. De hecho, aquí mostramos una vasodilatación dramática en los vasos arteriolares y venulares, pero no hay cambios en la densidad capilar, mientras que el CBFv aumenta, aunque los cambios en los capilares individuales son diversos. Por el contrario, con la anestesia Dex, no hubo vasoconstricción detectable y solo una disminución general menor de CBFv. En nuestros estudios anteriores, informamos grandes esfuerzos de Iso pero no de Dex en actividades neuronales y de astrocitos y CBFv20. Nuestros hallazgos actuales brindan evidencia adicional de que los estudios funcionales cerebrales realizados con Dex tienen menos probabilidades de ser confundidos por los efectos anestésicos que con isoflurano31. También evaluamos la anestesia con ketamina (ketamina/xilazina (cóctel de 87,5 mg/kg/12,5 mg/kg, ip), que entre varios objetivos actúa como antagonista del receptor del ácido N-metil-D-aspártico (NMDA) (NMDAR)49,50. mostró una disminución del CBFv regional en comparación con el estado de vigilia y observó redes cerebrovasculares muy inestables, lo que podría reflejar los efectos de múltiples dosis de ketamina requeridas para mantener la anestesia (Suplementario S3) Además, dado que la ketamina aumenta la señalización de dopamina en el cerebro, esto agrega otro confundir cuando se realizan estudios con cocaína o con otras drogas estimulantes.

Para evaluar los factores de confusión de la anestesia al evaluar los efectos de los agentes farmacológicos en las redes cerebrovasculares, seleccionamos la cocaína porque no solo es una droga muy adictiva sino también altamente neurotóxica impulsada en gran parte por sus efectos cerebrovasculares que contribuyen a la morbilidad y mortalidad. De hecho, la mortalidad por uso indebido de cocaína ha aumentado drásticamente en los EE. UU. con un estimado de 24 538 muertes en 2021. El estudio de modelos preclínicos de cocaína con herramientas de imágenes in vivo es clínicamente relevante para caracterizar los mecanismos subyacentes a los efectos vasoconstrictores de la cocaína y, por lo tanto, ayudar a desarrollar intervenciones. para mitigarlos.

La cocaína aguda redujo el CBFv general en las redes arterial, venular y capilar en ratones despiertos y anestesiados con Iso o dexanestesiados, pero las reducciones fueron mayores con Iso y similares para Dex y los estados despiertos. Sin embargo, en el estado de vigilia hubo más rebotes cortos (episodios) en CBFv, que probablemente estaban asociados con actividades motoras inducidas por la cocaína en la corteza sensoriomotora de los animales despiertos. Esto fue corroborado por la correlación temporal entre estos episodios transitorios de CBFv y los movimientos de los animales según lo evaluado por el aprendizaje autosupervisado para algoritmos de seguimiento de artefactos de movimiento (Suplementario S6 Fig. s5). Estos resultados indican que la magnitud de CBFv disminuye después de la cocaína aguda bajo anestesia con isoflurano; los informes anteriores podrían haber sido amplificados por la vasodilatación del anestésico y resaltan la importancia de realizar imágenes en animales despiertos.

Finalmente, evaluamos los efectos de la ketamina sobre los efectos cerebrovasculares de la cocaína. La ketamina, como la cocaína, aumenta la dopamina en el cerebro y tiene otros efectos funcionales cerebrales que podrían confundir los estudios que evalúan los efectos farmacológicos de la cocaína. Específicamente, (1) induce cambios en el CBF regional, los patrones de conectividad interregional y el metabolismo del glutamato51, (2) altera la disponibilidad de los transportadores de dopamina estriatal52, que son los objetivos de los efectos de la cocaína, (3) inhibe las consecuencias neuroendocrinas y conductuales de administración de cocaína53, y (4) apoya el refuerzo a través de la desinhibición de las neuronas dopaminérgicas en el área tegmental ventral54. El análisis cuantitativo no mostró cambios obvios en el CBFv después de la cocaína bajo anestesia con ketamina (S3 complementario).

Estudios preclínicos anteriores han documentado los efectos neurotóxicos de la cocaína crónica, incluida la vasoconstricción y la isquemia16,17,27,55. La mayoría de estos estudios por imágenes se realizaron bajo anestesia (p. ej., isoflurano), lo que probablemente confundió hallazgos como la vasodilatación de Iso que podría haber socavado los efectos vasoconstrictores a largo plazo de la cocaína. Gracias al procedimiento de implantación de ventana craneal crónica y las técnicas de cancelación de ruido/artefactos de movimiento basadas en aprendizaje profundo, ahora podemos rastrear cambios cerebrovasculares detallados que resultan de la exposición crónica a la cocaína en animales que se comportan despiertos, eliminando así los artefactos de confusión inducidos por la anestesia. Nuestros hallazgos documentaron una marcada hipofunción cerebrovascular en la corteza de animales despiertos después de la exposición crónica a la cocaína que podría ser la base de la vulnerabilidad a la isquemia y al accidente cerebrovascular con la exposición a la cocaína según lo informado por nuestro grupo y otros17. También notamos en base a las imágenes 3D µODT (Figs. 8, 9) que el CBFv capilar disminuido en animales con cocaína crónica ocurrió principalmente en las capas corticales superiores I–III (por ejemplo, 0–300 µm), mientras que los flujos arteriolares y venulares penetrantes se extendieron. a capas corticales más profundas (p. ej., 300 a 780 µm), probablemente prioricen la perfusión sanguínea en estas capas presumiblemente para mantener la actividad cortical en un cerebro hipoperfundido en general. Los mecanismos subyacentes a tales respuestas diferenciales a la cocaína crónica entre las capas corticales no están claros, pero podrían reflejar diferencias entre la dopamina y otros neurotransmisores y receptores (p. ej., noradrenalina) en la modulación del flujo o la actividad en las diversas regiones corticales56,57,58. Se necesitan más estudios sobre la vasodinámica y la neurofisiología asociada para comprender los mecanismos subyacentes de estos fenómenos, incluidos los cambios en las interacciones neuro-astroglio-vasculares. Cabe señalar que observamos una hipofunción cerebrovascular grave después de dosis repetidas de cocaína relativamente pequeñas a moderadas (p. ej., una cantidad total de 13 mg/kg de cocaína durante 25 días). Por lo tanto, es razonable anticipar que la neurotoxicidad podría ser mucho más devastadora si probamos un modelo de acceso prolongado de autoadministración de cocaína en el que los animales administran hasta 45 mg/kg/día de cocaína55.

Una limitación de este estudio fue que los cambios en la función celular (p. ej., la actividad neuronal y de los astrocitos) no se registraron simultáneamente, lo que podría haber permitido caracterizar las diferencias en la actividad neuronal sensorial y motora entre las condiciones de vigilia y anestesia. Por lo tanto, no podemos separar los cambios atribuidos a la actividad neuronal alterada (p. ej., actividades neuronales relacionadas con los sentidos frente a las motoras) de los que reflejan efectos cerebrovasculares directos para los efectos anestésicos o sus interacciones con la cocaína. Otra limitación es que, aunque se mantuvo bien la estabilidad fisiológica de los animales durante la adquisición de imágenes, no medimos la profundidad de la anestesia. Además, a diferencia de la vasoconstricción o la vasodilatación, los efectos sobre las redes capilares se cuantificaron como cambios en la densidad capilar (p. ej., factor de llenado).

En resumen, desarrollamos una innovadora técnica µOCA/µODT basada en aprendizaje profundo y autosupervisada, diseñada para imágenes cerebrovasculares 3D de alta resolución en animales despiertos. Para demostrar el potencial de esta técnica para la obtención de imágenes cerebrales funcionales de animales despiertos, la aplicamos para documentar las posibles perturbaciones de los factores de confusión anestésicos en la hemodinámica cerebral (CBFv) en respuesta a la cocaína. Los hallazgos de nuestro estudio que documentan interacciones significativas entre los anestésicos y los efectos farmacológicos de la cocaína pueden ser clínicamente relevantes. Por ejemplo, estudios preclínicos y clínicos informaron que los efectos tóxicos de la cocaína se ven acentuados por el alcohol59, que tiene efectos anestésicos60,61, por lo que la toxicidad aumentada podría reflejar tales interacciones. Nuestros hallazgos también son relevantes para ayudar a interpretar los estudios preclínicos de neuroimagen de la cocaína realizados bajo anestesia e informar futuros estudios para la selección de un agente anestésico cuando los estudios no se pueden realizar en animales despiertos. Nuestro estudio también contribuye al avance de las herramientas de neuroimagen, incluido el uso de técnicas de procesamiento de imágenes mejoradas con aprendizaje profundo que se pueden usar para medir los efectos farmacológicos de las drogas en animales despiertos. Además, al aplicar el aprendizaje autosupervisado avanzado, podemos eliminar y minimizar los artefactos de movimiento de manera efectiva y, lo que es más importante, monitorear el movimiento del animal despierto, lo cual es relevante para las actividades motoras. Este enfoque podría usarse para estudiar la patología cerebrovascular crónica provocada por la cocaína, por ejemplo, el ataque isquémico transitorio y la parálisis asociada en un modelo animal despierto y, por lo tanto, ayudar a avanzar en nuestra comprensión de cómo prevenirla y tratarla62,63.

Se utilizaron ratones C57BL (Jackson Laboratory) de 6 a 8 semanas de edad. Se usó un total de 29 ratones para realizar 53 experimentos de imágenes, en los que se usaron 13 ratones en 26 experimentos para caracterizar las diferencias de flujo entre los estados anestesiados y despiertos como estudio de referencia, y se usaron 16 ratones en 27 experimentos para acceder a los datos agudos/crónicos. efectos de la cocaína en el flujo sanguíneo cerebral como un ejemplo de la tecnología para el estudio funcional del cerebro. La Tabla S2 complementaria s1 resume los detalles experimentales de los grupos de animales para comparar las diferencias de CBFv entre los estados anestesiados y despiertos, y aquellos para estudiar los efectos de la cocaína en las redes corticales de CBFv. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook y se realizaron de acuerdo con las Pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Para implantar una ventana craneal en la corteza de cada ratón, después de la anestesia con isoflurano inhalado mezclado con O2 puro (4 % para la inducción, 1–2 % para el mantenimiento), la cabeza del ratón se fijó firmemente en un marco estereotáxico con la temperatura corporal mantenida en ~37 °C y se abrió cuidadosamente una ventana craneal crónica de ~3 × 4 mm2 por encima de la región de la corteza sensoriomotora (A/P −2,0, M/L−2,0). La superficie cortical expuesta se humedeció inmediatamente con gel de agarosa al 2% y se fijó firmemente con un cubreobjetos de vidrio de 160 μm de espesor aplicando primero pegamento cianocrílico biocompatible y luego cemento dental (MIA622, HE Parmer Co.) a los bordes del cubreobjetos para asegurar su unión con el cráneo, asegurando así la inmovilización del cerebro y minimizando los artefactos de movimiento durante la proyección de imagen despierto. Se aplicaron cuatro microtornillos (MX-0090-01SP, Component Supply Co.) para fijar una placa de cabeza de metal al cráneo circundante por encima de la ventana craneal y se aseguraron con cemento dental (MIA622, HE Parmer Co. Inc.). La herida que rodeaba la ventana craneal se suturó, esterilizó y el ratón recibió tratamientos antibióticos y antiinflamatorios (si era necesario) para garantizar la limpieza óptica a largo plazo. El estado fisiológico del ratón, incluida la electrocardiografía (ECG), la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal, se controló continuamente (SA Instruments, NY) durante los experimentos. Todos los procedimientos siguieron las pautas de esterilización para cirugía de supervivencia.

Se usó una jaula móvil para roedores inflada con aire personalizada (cinta de correr) para entrenar ratones con la cabeza fija para reducir los artefactos de movimiento para la obtención de imágenes del cerebro de animales conscientes30. La jaula móvil en forma de cilindro (p. ej., ϕ24 mm × 8 mm) hecha de lámina rígida de fibra de carbono ultraligera, se flotó ~0,8 mm sobre una mesa inflada con aire (p. ej., ϕ380 mm) para permitir el libre movimiento en direcciones horizontales arbitrarias cuando un ratón intentó caminar o correr. La jaula móvil creó la ilusión de correr libremente mientras mantenía la cabeza del animal estacionaria para obtener imágenes ópticas sin movimiento de la función cerebral. Sin embargo, la fijación de la cabeza induce un estrés que podría desencadenar efectos confusos en los estudios neurofisiológicos y los micromovimientos cerebrales podrían, a su vez, comprometer la detección de imágenes ópticas. Para habituar a los animales al procedimiento de formación de imágenes fijas en la cabeza y para minimizar los artefactos de movimiento, los animales se entrenaron en las mismas condiciones que los de las sesiones de formación de imágenes despiertos. Se adoptó un entrenamiento de tres días con múltiples sesiones de entrenamiento extendidas, durante las cuales los ratones tenían la cabeza fija mientras estaban de pie en la jaula móvil inflada con aire y el tiempo de entrenamiento por sesión aumentó progresivamente de 10 min a 30 min y 60 min y las sesiones de entrenamiento aumentaron. de 1 sesión en el día 1 a 3 sesiones en el día 3. El área que rodea la cabeza del ratón se cubrió con un paño negro para minimizar la interferencia de los estímulos ambientales visuales y de audio64, y los signos de estrés se controlaron mediante la aparición de vocalizaciones y movimientos durante el entrenamiento. sesiones65,66. Los protocolos de animales para la preparación, el entrenamiento y las imágenes in vivo de los animales fueron aprobados por los Comités institucionales de uso y cuidado de animales de la Universidad de Stony Brook y siguieron las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Se realizaron imágenes 3D in vivo de microvasculatura y redes de velocidad de flujo sanguíneo cerebral (CBFv) en la corteza sensoriomotora de ratones anestesiados o despiertos en una configuración personalizada de tomografía de coherencia óptica (μOCT) de ultra alta resolución, en la que una fuente de luz de banda ultraancha (I = 8mw; λ = 1310 nm, ΔλFWHM ≈ 200 nm) iluminó un interferómetro Michelson de fibra óptica aplanado de 2 × 2 longitudes de onda, capaz de lograr una resolución axial de 2,5 µm en tejido biológico (es decir, longitud de coherencia Lc = 2(ln2) 1/2/π·λ2/ΔλFWHM). La luz que salía del brazo de la muestra se colimó a ϕ3–4 mm, se escaneó transversalmente con un servo menor y se enfocó a través de la ventana craneal crónica en la corteza sensoriomotora del ratón mediante un doblete acromático NIR (f18 mm/NA 0,25, Edmond Optics), lo que produjo una resolución lateral máxima de 3,2 µm. La luz que regresaba de la muestra y los brazos de referencia se recombinó en la fibra de detección, se colimó y difractó linealmente con un espectrómetro personalizado y se detectó con una cámara InGaAs de exploración de líneas de 2k píxeles (2048 R, Sensors Unlimited) a hasta 147k líneas A/ s. La proyección de máxima intensidad (MIP) de En-face de las redes CBFv se reconstruyó instantáneamente a través de la unidad de procesamiento gráfico (GPU) impulsada por la programación de GUI personalizada para permitir la visualización en tiempo real de las redes de flujo, por ejemplo, a 2 M píxeles por sección transversal o B- escanea tan rápido como 473 fps. Las imágenes 3D de las redes de microvasculatura (µOCA) y CBFv (µODT) en la corteza del ratón se reconstruyeron mediante el análisis de varianza de motas y el método de sustracción de fase, respectivamente11,13,15 (Nota complementaria S1 para más detalles).

Para minimizar los artefactos de movimiento críticos para la obtención de imágenes 3D µOCA/µODT de animales despiertos, se implementaron modificaciones del escáner OCT, incluido el acortamiento de la ruta óptica en el brazo de muestra, el uso de mecano-óptica moldeada y el diseño de una placa de transición rígida de Ti que interconecta el ventana craneal del ratón y la sonda OCT. Además, se optimizaron los paradigmas de adquisición de imágenes, por ejemplo, aumentando los escaneos B repetidos de 4 cuadros a 14 cuadros para µOCA y aumentando la velocidad de escaneo A a 8 kHz con puntos de escaneo A reducidos a 10k para µODT de campo completo para eliminar de manera efectiva el ruido de movimiento. a través del procesamiento posterior a la imagen.

Para cambiar de la condición despierta a la anestesiada durante la obtención de imágenes, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2,0-2,5 % por inhalación (Iso) o mediante una inyección intraperitoneal de dexmedetomidina (Dex, 0,025 mg/kg, ip). El mantenimiento de la anestesia se confirmó por la falta de respuesta al dolor y tasas de respiración estables (Small Animal Instrumentation, Modelo 1025 L). La cocaína se administró mediante inyecciones en la vena de la cola (1 mg/kg, iv) para comparar los cambios hemodinámicos inducidos por la cocaína (p. ej., vasoconstricción o dilatación, cambios en el CBFv) entre los estados despierto y anestesiado (p. ej., Iso, Dex). A modo de comparación, se administró (ip) ketamina como agente anestésico, que contenía un cóctel de 87,5 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina, para cambiar de estado de vigilia a estado anestesiado durante la obtención de imágenes, y también para realizar un seguimiento de los cambios de CBFv inducidos por la cocaína en la corteza animal. Los procedimientos experimentales detallados se describen en el Suplemento S3.

3D μODT y μOCA se reconstruyeron mediante el método de resta de fase que derivó la velocidad del flujo (cambio de frecuencia Doppler ν) a partir de la diferencia de fase entre 2 escaneos A adyacentes y calculando la varianza del moteado (es decir, desviación estándar normalizada) entre escaneos B adyacentes, respectivamente (Nota complementaria S1). Se utilizó μODT para discernir los flujos arterial y venal16. Brevemente, la velocidad del flujo Doppler ν se asigna (+/-) como un producto de la dirección del flujo o la diferencia de fase y el ángulo del flujo θz (es decir, cosθz "+" para 00-900, "-" para 900-1800); por lo tanto, al aplicar la matriz Hessiana a la pista θz, se puede determinar la dirección del flujo a lo largo de un recipiente. Si la dirección del flujo en un árbol de vasos grandes es hacia las ramas (p. ej., ramificación), es una arteria/arteriola; si las direcciones de flujo de las ramas se fusionan en vasos más grandes (p. ej., se ramifican), se trata de una vena/vénula16.

Los artefactos en µOCA inducidos por movimiento masivo (p. ej., movimiento de animales) tienden a aumentar los artefactos de movimiento similares a rayas; por lo tanto, la supresión de los artefactos de movimiento es fundamental para permitir la detección precisa de la microvasculatura, especialmente para la obtención de imágenes de animales despiertos. Aquí, esto se implementó mediante un enfoque combinado. Como los artefactos de movimiento dan como resultado una descorrelación sustancial en múltiples B-scans debido a la deriva o fluctuación instantáneas, se adquirieron B-scans adicionales (p. ej., N = 14), entre los que se encuentran los B-scans más correlacionados (p. ej., N' = 6, rCorr > 0.9) fueron seleccionados para reconstruir la exploración B de µOCA a través del algoritmo de variación de motas para el preprocesamiento para suprimir los artefactos de movimiento (Nota complementaria S1).

Aunque el preprocesamiento de B-scan pudo corregir la mayoría de los artefactos de movimiento resultantes de un movimiento moderado, permanecieron algunos ruidos de rayas grandes e intratables del movimiento severo, que a menudo abarcaban varios B-scan adyacentes (Fig. 2a). Para suprimir aún más los artefactos de movimiento, se empleó un método basado en gradientes, por ejemplo, flujo orientado de forma óptima, para producir la segmentación binaria inicial de las redes cerebrovasculares44,67. A medida que los escaneos B colapsaron por ruidos similares a rayas, dichas rayas se eliminaron primero y luego sus regiones se recuperaron mediante un modelo de pintura sensible a la estructura basado en aprendizaje profundo efectivo, que fue diseñado para llenar las máscaras de los vasos en el eliminado regiones de vasos40,44. Más específicamente, el modelo integró la información de la vasculatura en términos de gradientes de imagen en el área de la franja original para guiar el proceso de recuperación, que siguió la arquitectura decodificador-codificador con módulos GatedConv para pintar41. Tal información de estructura trajo pistas adicionales que fueron ignoradas por los métodos existentes y, por lo tanto, aumentó la solidez de nuestro modelo de pintura interna, especialmente para franjas anchas que plantearon grandes desafíos para estos métodos. Además, la información de la estructura en el área clara se utilizó por completo para entrenar nuestro modelo de manera autosupervisada, evitando así la necesidad de costosas anotaciones manuales. Para más detalles, en la Fig. 10a se muestra un diagrama del modelo de aprendizaje autosupervisado. Después de generar la máscara de vasos binarios sin artefactos de movimiento (p. ej., Fig. 2b), se multiplicó con la imagen MIP µOCA de entrada para proporcionar la imagen µOCA mejorada para ilustrar las redes microvasculares 3D sin artefactos de movimiento en el cerebro del ratón ( por ejemplo, Fig. 2c). La máscara binarizada Fig. 2b también se usó para calcular la densidad de flujo capilar (CD) como se muestra en la Fig. s4 complementaria S5.

un diagrama de flujo del modelo de aprendizaje profundo autosupervisado para aprender patrones de ruido inducidos por movimiento (es decir, flechas verdes) y para reducir de manera efectiva los ruidos y artefactos (por ejemplo, flechas rojas). BMA: artefactos de movimiento masivo; CNN: red neuronal convolucional. b Diagrama de flujo del modelo de mejora de µODT 3D autosupervisado para aprender características invariantes vasculares (p. ej., flecha verde) para suprimir los ruidos de fondo en el volumen original (p. ej., flecha roja).

Mientras tanto, se derivó un modelo de aprendizaje autosupervisado para mejorar los flujos microvasculares en volúmenes µODT 3D, que aprendieron las características vasculares invariantes de los módulos Intensity Remapping (IR) y Vessel Cropping (VC). Basándose en las estadísticas sobre la distribución de datos, el módulo IR generó vasos de diferentes intensidades para guiar el aprendizaje de las características de intensidad invariable. Además, el módulo VC se utilizó para fomentar la conectividad vascular de la predicción. Para ser específicos, algunos segmentos de los vasos se eliminaron al azar para entrenar al modelo para que aprenda las características vasculares mediante la restauración de los segmentos eliminados; por lo tanto, nuestro modelo no solo mejoró el contraste de la imagen sino que también mejoró la conectividad del buque. En comparación con otros métodos autosupervisados, nuestro modelo no necesitaba pares de imágenes claras/ruidosas o ruidosas/ruidosas y, por lo tanto, es más práctico en las aplicaciones biomédicas relacionadas con µODT. Se usó CNN 3D estilo UNet como columna vertebral, como se ilustra en la Fig. 10b. Después de que el entrenamiento convergió, nuestro modelo convirtió un volumen µODT ruidoso directamente en un volumen µODT mejorado de manera efectiva (por ejemplo, de la Fig. 2d, e. Además de eliminar los artefactos de movimiento, el método de autoentrenamiento eliminó efectivamente el ruido de fondo y mejoró el contraste de la imagen. , mejorando las redes de flujo capilar débiles en regiones de baja SNR.

Para cuantificar el CBFv y comparar sus diferencias, se seleccionaron aproximadamente 4–6 recipientes para cada tipo de recipiente en cada animal para muestrear sus cambios de velocidad de flujo y calcular sus medias y errores estándar, en los que los puntos de muestreo (p. ej., i = 1,…, 6) y se destacaron los trazos correspondientes en rojo, azul y verde para los flujos arterial, venal y capilar, respectivamente. Los cambios de las redes microvasculares (p. ej., vasodilatación o vasoconstricción) se presentaron como sus cambios relativos, es decir, Δϕ=(ϕ–ϕ0)/ϕ0, donde ϕ0 se refiere al tamaño del vaso de referencia. De manera similar, los cambios en el flujo sanguíneo medidos por µODT se presentaron como ΔCBFv = (CBFv–CBFv0)/CBFv0, donde CBFv0 se refiere a la tasa de flujo de referencia correspondiente.

Las pruebas estadísticas se realizaron con el software SYSTAT (Chicago, IL, EE. UU.). Las diferencias en el CBFv y el diámetro del vaso entre los estados despierto y anestésico (p. ej., ISO, DEX) y entre el inicio y después de la inyección de cocaína se evaluaron mediante pruebas t de dos colas o pruebas de suma de rangos. Los cambios de CBFv, la vasoconstricción o la dilatación se probaron para determinar la diferencia significativa utilizando ANOVA de medidas repetidas unidireccionales seguido de una prueba post hoc (método de Holm-Sidak). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y NS indica que no es significativo. Todos los datos se presentan como media ± estándar para cambios porcentuales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los conjuntos de datos de origen presentados en este estudio se incluyen en los archivos de datos complementarios 1 y 2. Los datos adicionales, especialmente para imágenes 3D sin procesar grandes, están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación fue apoyada en parte por subvenciones 2R01DA029718 (CD, YP) ​​y 1RF1DA048808 (YP, CD) de los Institutos Nacionales de Salud.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, NY, 11794, EE. UU.

Yingtian Pan, Parque Kicheon y Congwu Du

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, NY, 11794, EE. UU.

Jiaxiang Ren y Haibin Ling

Instituto Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20857, EE. UU.

Nora Volkow

Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Alan P. Koretsky

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CD, NDV y YP diseñaron la investigación. KP llevó a cabo los experimentos in vivo y el análisis de datos; JR y HL realizaron un procesamiento de imágenes basado en el aprendizaje autosupervisado (KP y JR contribuyeron por igual). YP, CD, NVD y AK contribuyeron a la interpretación de datos, discusiones de resultados y redacción de manuscritos.

Correspondencia a Yingtian Pan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Chao Zhou y Manuel Breuer. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Pan, Y., Park, K., Ren, J. et al. Imágenes dinámicas en 3D del flujo sanguíneo cerebral en ratones despiertos mediante tomografía Doppler de coherencia óptica mejorada con aprendizaje autosupervisado. Comun Biol 6, 298 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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Recibido: 05 Mayo 2022

Aceptado: 03 de marzo de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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